酶标仪的技术原理与操作指南

　　一、技术原理

　　酶标仪，即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附试验(ELISA)的专用仪器。它基于光电比色法或荧光检测法，通过测量样本对特定波长光的吸收程度或荧光信号强度，实现对生物样本中待测物的定性和定量分析。

　　(一)光电比色法原理

　　酶标仪的光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔板中的待测标本。单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将这些光信号转换成相应的电信号，经过一系列信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系，检测单位用OD值(光密度)表示，OD值与光强度之间的关系遵循Bouger-amberT-beer法则。

　　(二)荧光检测法原理

　　在荧光检测中，酶标仪通过特定波长的激发光照射样本，使样本中的荧光物质发出荧光。光电检测器接收荧光信号并将其转换为电信号，经过处理后得到荧光强度值，该值与样本中荧光物质的浓度成正比。

　　(三)波长选择与双波长检测

　　在测定检测物时，选择特定的波长进行检测，称为测量波长。但每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，再选取一个参照波长。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。例如，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定最-常用的，考虑到双波长比色的需要，还应有630nm和405nm波长的滤光片。

　　二、操作指南

　　(一)准备工作

　　仪器放置：将酶标仪、配套的电脑及主机等放在平稳、干燥的地方。

　　电源连接与预热：将酶标仪与电脑连机，依次打开电脑和酶标仪的开关，等待自检，预热5 - 30分钟(不同型号仪器预热时间可能不同)，使仪器达到稳定状态。在预热过程中，可根据具体情况设置所需要的波长和光线强度。

　　软件启动与程序设置：打开与仪器配套的软件，建立新的检测程序或打开已有程序。创建新程序时，选择所需创建的程序协议，如吸光值、化学发光、荧光强度等;选定试验协议后，进行波长选定、酶标板选定，并设置protocol参数，如酶标板震荡混匀样品的时间、测量样品结果的时间、样品波长扫描范围以及样品环境温度等。修改已有程序时，在酶标仪打开界面中选定一个protocol，然后双击进入程序设置界面进行相应修改。

　　(二)样品准备

　　样品制备与稀释：根据实验要求，准备好待检测的样品和标准品，并进行相应的稀释和加样。同时，应控制好稀释倍数，避免样品浓度过高或过低的影响。

　　微孔板布置：在酶标板中按照实验设计布置待测和标准样品，每个孔位加入适量的稀释后的样品。同时，在同一板中添加对照组和空白对照。

　　(三)试剂添加

　　根据实验需求加入辅助试剂，如底物和酶标记等。加入试剂时需要严格按照实验流程进行，按照正确的顺序和比例加入试剂，避免污染和误差。

　　(四)混匀和孵育

　　轻轻摇晃或轻轻拍打酶标仪板，确保样品和试剂充分混合。将酶标仪板放置在恒温条件下的孵化箱中进行相应的孵育时间，以促进反应的进行。

　　(五)反应停止和读数

　　反应停止：在孵育结束后，根据试剂盒说明书中的指导，加入适当的反应停止剂，终止反应。

　　读数操作：将酶标仪板放置在酶标仪中，根据所测定的具体物质选择相应的波长或滤光片，读取吸光度或荧光强度值。

　　(六)数据处理

　　根据实验需要，使用软件或计算公式将读数结果转化为所需的具体物质的浓度或活性。点击电脑软件上的“编辑"栏中的“复制到Excel"，导出数据后进行数据处理和分析。

　　(七)仪器清理与维护

　　取出酶标板：数据处理完成后，打开仪器盖，取出酶标板。

　　仪器清洁：盖好仪器盖，关闭酶标仪电源，并将仪器擦拭干净。

　　定期维护：按照设备的维护手册，定期进行维护和检修工作，包括校准和更换部件等。定期检查仪器状态，如光源是否正常、滤光片是否清洁等;仪器出现故障时，应及时联系专业工程师进行维修，避免盲目自行设置。